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稳转株构建过程有关细胞瞬时转染的说明

  • 发布日期:2021-07-02      浏览次数:61
    •    稳转株构建是利用哺乳动物系统生产蛋白,主要方式有瞬时转染和稳转株筛选两种。通过稳定细胞系构建筛选稳定表达细胞株。针对瞬时转染,外源基因在短时间转录翻译得到的蛋白量较少,1mg质粒得到1mg蛋白,能够满足小量蛋白制备,大量生产成本很高。稳定转染的是将外源基因整合到细胞自身的基因组上,随着细胞的生长分裂外源基因可以稳定表达,同时经过抗生素加压筛选,最终得到能够稳定表达蛋白的稳定细胞系。
        瞬时转染以Lipofectamine转染试剂为例的操作流程,不同转染试剂请参考说明书:
        1.将复苏后常规培养的细胞按照1-3x10^5接种到6孔板中,加入2-4ml的完全培养基,混匀放置在二氧化碳培养箱中37℃过夜;
        2.无菌状态下配置如下溶液
        ①用100ul的无血清培养基稀释2ug的待转染的质粒;
        ②用100ul的无血清培养基稀释25ul的Lipofectamine转染试剂(血清的存在会影响转染效率,因此要使用无血清培养基转染)。
        3.将ab溶液混合并摇匀,室温下放置30min左右;
        4.细胞培养至80%单层左右,用无血清培养基洗涤细胞2次,每孔加入1ml的无血清培养基,并将混合后的ab溶液逐滴加入到每孔,按十字方向轻摇混匀,二氧化碳培养箱中37℃培养24小时;
        5.将转染液倒出,换为完全培养基继续培养。
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