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重组蛋白表达要统一考虑和整体设计

  • 发布日期:2021-07-30      浏览次数:19
    •   重组蛋白表达的常见问题是真核蛋白在细菌中表达时倾向于不溶。变性,聚集和/或截短形式的蛋白形成不可溶的包涵体,需要进一步纯化和重折叠,这可能是低效的和不完全的。
        分离纯化组成了基因工程的下游处理(downstream processing)阶段,这一过程又和上游过程紧密相联系,上游过程的诸方面影响到下游的分离纯化,所以在进行目标蛋白质表达纯化时要统一考虑和整体设计,并充分考虑上游因素对下游的影响,如是否带有亲和标签,是否进行分泌表达。目前应用最广泛的表达系统有三大类,分别是大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和CHO细胞表达系统,不同的表达系统和培养方法显著影响下游的处理过程,目标蛋白表达是否形成包涵体,目标蛋白表达的定位(胞内、细胞内膜、周质空间和胞外),蛋白表达的量都依赖于所选择的表达系统。
        选择将所表达的蛋白分泌到细胞外或周质空间可以避免破碎细胞的步骤,并且由于蛋白质种类少,目标蛋白容易纯化;而在细胞质内表达蛋白,可能是可溶性表达,可能形成包涵体,可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤,而包涵体易于分离,纯度较高,但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难,需要对聚集的蛋白进行变复性,通常活性蛋白的得率比较低,表1列出了不同策略对表达、纯化的影响,对于其中的有些缺点可以通过一定的方法进行克服和避免,如利用DNA重组技术给外源蛋白加上一个亲和纯化的标签,有助于可溶性外源蛋白的选择性纯化,并能保护日标蛋白不被降解(96)。
        在细胞的提取物中,除了目标蛋白外,还含有其它各种性质的蛋白、核酸、多糖等。在这样一个混合体系中,蛋白质纯化要求将目标蛋白与其它的成分分离,得到一定的量,达到一定的纯度,同时要尽可能保留蛋白的生物活性,并使蛋白保持完整。所以蛋白质的分离纯化可以看作是一系列的分部收集过程,总是希望目标蛋白富集于其中的一个收集部位,而大量的杂蛋白存在于其它的收集部位。当然对目标蛋白纯度的要求要根据纯化蛋白的用途而定,对于治疗性的蛋白要求有大于99%的纯度,并对处方有活性和稳定性的要求,对于某些酶的纯度则要求较低,需要在纯度和得率之间进行一个平衡,所以下游的工艺流程取决于最终对目标蛋白的要求。
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