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质粒表达载体

质粒表达载体

简要描述:
质粒表达载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异,适应目的基因与载体易于链接,不能产生阅读框架错位。抗生素抗性基因可以便于加以检测,如 Amp+ ,Kan+(3)多克隆位点MCS克隆携带外源基因片段

更新时间:2021-12-15

访问量:215

厂商性质:生产厂家

生产地址:上海

质粒表达载体注意事项:转化前请准确查找该质粒相应的抗生素名称、抗生素使用浓度、感受态名称和培养温度。
1、收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min,再加入20μl~50μl无菌水或 pH8.0  1*TE缓冲液来溶解质粒,室温放置1min

2、从-80冰箱中取出相应的感受态,置于冰盒上解冻,并做好标记;

3、取2μl质粒加至100μl感受态中,冰浴30min

442热激90s,再冰浴2min

5、加入900μl无抗的LB液体培养基,180rpm震荡培养45min

66000rpm离心5min,仅留100ul上清混匀菌体沉淀;

7、混匀后的菌液加至对应抗性的LB平板上,倒入适量玻璃珠,涂匀液体;

8、将平板正向培养1h,再倒置培养12h~16h

9、挑取单克隆菌落至对应抗性的LB液体培养基中,震荡培养12h~16h,根据实验需要提取质粒

pET28a-NSP13(SARS-CoV-2)蛋白表达质粒
pET28a-NSP1(SARS-CoV-2)蛋白表达质粒
pLVX-6×NFAT-IL20-CCL20-EF1a-CDR19(mouse)-EGFR-WPRE蛋白表达质粒
pHIV-EF1a-MCS-IRES-EGFP蛋白表达质粒
pLKO.1-mCherry-P2A-Neo基因沉默质粒
pUCP18基因克隆质粒
pAAV-CMV-MCS-PGK-EGFP-E2A-Puro蛋白表达质粒
pMIGR1-FLAG-BCR-ABL-P210-T1216I蛋白表达质粒
pLKO.1-U6-USP37(human)-shRNA3-hPGK-Puro基因沉默质粒

 

  目前,载体主要有非病毒和病毒两大类。非病毒载体可以实现基因的顺式中表达,周期较短,操作简单。病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达目的序列的效果。对于一些较难转染的细胞,如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,使用慢病毒载体,能大大提高目的基因的转导效率,能够比较方便快捷地实现目的基因的长期、稳定表达。

  可以根据您的需要创造新的基因(质粒构建),表达后可拥有新的蛋白质,即通常说的重组蛋白或融合蛋白(质粒表达)。我举个例子,加入蛋白质ABC和DEFG分别由三个结构域和四个结构域组成,而你需要分子量小且具有第一个蛋白A结构域的功能和第二个蛋白中G结构域的功能,那么你可将AG基因克隆,装入载体后进行表达,这样产生了新蛋白AG。当然这只是理论上,新蛋白表达后是否能够具有原来AG的功能,能否表达出来,表达量高低等等都是你所要考虑的问题。

  一、载体的选择及如何阅读质粒图谱

  目前,载体两大类,其中质粒DNA是一种新的非病

  毒转基因载体。

  一个合格质粒的组成要素:

  (1)复制起始位点Ori即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而

  真核生物DNA分子有多个复制起始位点。

  (2)抗生素抗性基因可以便于加以检测,如 Amp+ ,Kan+(3)多克隆位点MCS克隆携带外源基因片段

  (4)P/E启动子/增强子

  (5 )Terms终止信号

  (6)加poly (A)信号可以起到稳定mRNA 作用

  选择载体主要依据构建的目的,同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目

  的是要表达一个特定的基因,则要选择合适的表达载体。载体选择主要考虑下述3点:

  【1】构建DNA重组体的目的,克隆扩增/基因表达,选择合适的克隆

  载体/表达载体。

  【2】.载体的类型:

  (1)克隆载体的克隆能力一据克隆片段大小(大选大,小选小)。如

  <10kb选质粒。

  (2)表达载体据受体细胞类型一原核/真核/穿梭,E.coli/哺乳类细胞表

  达载体。

  (3)对原核表达载体应该注意:选择合适的启动子及相应的受体菌,

  用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位;表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。

  【3】载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异,适应目的基因与载体易于链接,不能产生阅读框架错位。

  综上所述,选用质粒做载体的5点要求:

  (1)选分子量小的质粒,即小载体( 1—1.5kb)→不易损坏,在细菌里

  面拷贝数也多(也有大载体);

  (2)一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束,一般10个以上的拷

  贝,而严谨型质粒<10个。

  (3)必需具备一个以上的酶切位点,有选择的余地;

  (4)必需有易检测的标记,多是抗生素的抗性基因,不特指多位 Ampr(试一试)。

  (5)满足自己的实验需求,是否需要包装病毒,是否需要加入荧光标记,

  是否需要加入标签蛋白,是否需要真核抗性(如 Puro、G418)等等。

  无论选用哪种载体,首先都要获得载体分子,然后采用适当的限制酶将载体DNA进行切割,获得线性载体分子,以便于与目的基因片段进行连接。

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