质粒表达载体

质粒表达载体注意事项：转化前请准确查找该质粒相应的抗生素名称、抗生素使用浓度、感受态名称和培养温度。
1、收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl~50μl无菌水或 pH8.0 的 1*TE缓冲液来溶解质粒，室温放置1min；

2、从-80℃冰箱中取出相应的感受态，置于冰盒上解冻，并做好标记；

3、取2μl质粒加至100μl感受态中，冰浴30min；

4、42℃热激90s，再冰浴2min；

5、加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡培养45min；

6、6000rpm离心5min，仅留100ul上清混匀菌体沉淀；

7、混匀后的菌液加至对应抗性的LB平板上，倒入适量玻璃珠，涂匀液体；

8、将平板正向培养1h，再倒置培养12h~16h；

9、挑取单克隆菌落至对应抗性的LB液体培养基中，震荡培养12h~16h，根据实验需要提取质粒

　　目前，载体主要有非病毒和病毒两大类。非病毒载体可以实现基因的顺式中表达，周期较短，操作简单。病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因的转导效率，能够比较方便快捷地实现目的基因的长期、稳定表达。

　　可以根据您的需要创造新的基因（质粒构建），表达后可拥有新的蛋白质，即通常说的重组蛋白或融合蛋白（质粒表达）。我举个例子，加入蛋白质ABC和DEFG分别由三个结构域和四个结构域组成，而你需要分子量小且具有第一个蛋白A结构域的功能和第二个蛋白中G结构域的功能，那么你可将AG基因克隆，装入载体后进行表达，这样产生了新蛋白AG。当然这只是理论上，新蛋白表达后是否能够具有原来AG的功能，能否表达出来，表达量高低等等都是你所要考虑的问题。

　　一、载体的选择及如何阅读质粒图谱

　　目前，载体两大类,其中质粒DNA是一种新的非病

　　毒转基因载体。

　　一个合格质粒的组成要素:

　　(1）复制起始位点Ori即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而

　　真核生物DNA分子有多个复制起始位点。

　　(2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如 Amp+ ,Kan+(3）多克隆位点MCS克隆携带外源基因片段

　　(4)P/E启动子/增强子

　　(5 )Terms终止信号

　　(6）加poly (A）信号可以起到稳定mRNA 作用

　　选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目

　　的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。载体选择主要考虑下述3点:

　　【1】构建DNA重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆

　　载体/表达载体。

　　【2】.载体的类型:

　　(1）克隆载体的克隆能力一据克隆片段大小(大选大，小选小)。如

　　<10kb选质粒。

　　(2）表达载体据受体细胞类型一原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表

　　达载体。

　　(3)对原核表达载体应该注意:选择合适的启动子及相应的受体菌，

　　用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位;表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。

　　【3】载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。

　　综上所述，选用质粒做载体的5点要求:

　　(1）选分子量小的质粒，即小载体（ 1—1.5kb）→不易损坏，在细菌里

　　面拷贝数也多（也有大载体）;

　　(2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷

　　贝，而严谨型质粒<10个。

　　(3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地;

　　(4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位 Ampr(试一试)。

　　(5)满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，

　　是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如 Puro、G418）等等。

　　无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA进行切割，获得线性载体分子，以便于与目的基因片段进行连接。