您现在的位置:首页 > 技术文章 > 质粒菌株库提取质粒时提取率低的原因探讨

质粒菌株库提取质粒时提取率低的原因探讨

  • 发布日期:2021-07-21      浏览次数:45
    •    质粒菌株库以PCR扩增为基础的各类载体构建,如大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、杆状病毒表达载体、哺乳动物表达载体;报告基因载体等。对于质粒菌株库中质粒的提取可能会出现未提出质粒或质粒提取率较低的现象,如何分析解决呢?
        1.大肠杆菌老化:涂布平板培养后,重新挑选新菌落进行液体培养。
        2.质粒拷贝数低:由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低,可更换具有相同功能的高拷贝数载体。
        3.菌体中无质粒:有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在,经多次转接后有可能造成质粒丢失。不要频繁转接,每次接种时应接种单菌落。另外,检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。
        4.碱裂解不充分:使用过多菌体培养液,会导致菌体裂解不充分,可减少菌体用量或增加溶液的用量。对低拷贝数质粒,提取时可加大菌体用量并加倍使用溶液,可以有助于增加质粒提取量和提高质粒质量。
        5.溶液使用不当:溶液在温度较低时可能出现浑浊,应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液,才能使用。
        6.吸附柱过载:不同产品中吸附柱吸附能力不同,如果需要提取的质粒量很大,请分多次提取。
        7.质粒未全部溶解(尤其质粒较大时):洗脱溶解质粒时,可适当加温或延长溶解时间。
        8.乙醇残留:漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体,再加入洗脱缓冲液。
        9.洗脱液加入位置不正确:洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。
        10.洗脱液不合适:DNA只在低盐溶液中才能被洗脱。洗脱效率还取决于pH值,最大洗脱效率在pH7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内,如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用,有利于提高洗脱效率。
        11.洗脱体积太小:洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高,但产品浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。
        12.洗脱时间过短:洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时放置1min可达到较好的效果。
    在线咨询