稳转细胞株

稳转细胞株

货号：C10000

稳转细胞株构建

外源基因在细胞中的表达可分为两大类，一类是瞬时表达，一类是稳定表达。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，虽然可以达到高水平的表达，但通常只持续几天。后者外源DNA整合到宿主细胞染色体上，使宿主细胞可*表达目的基因。建立稳定细胞株，一般是根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物对靶细胞进行筛选。抗性标记基因有潮霉素（hygromycin）、新霉素（neomycin）和嘌呤霉素（puromycin），Hygromycin B、G418和puromycin进行选择性筛选。传统的稳定株筛选方法需要通过外源基因的瞬时转染后对靶细胞进行筛选， 终获得从单一细胞扩增起来的稳定细胞株， 该方法阳性率低，周期长，工作量大。慢病毒是一种RNA病毒，携带的外源基因在病毒感染细胞后需要逆转录为DNA，再整合到宿主细胞基因组以后才能表达。 利用慢病毒必须整合到宿主基因组的特性来筛选稳定株的方法克服了传统方法的弊端，可以在短时间内获得高效率的稳定细胞株。筛选得到的细胞或者可稳定表达目的蛋白，用于蛋白的扩增和富集；或者得到稳定沉默特定基因的细胞株

1.需客户告知目的基因具体信息，确定稳转细胞系的类型

2.提供相关的实验图片、实验数据、构建完成的稳转细胞系

3.周期 价格更多详细内容请联系客服

稳转细胞株

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是一种经过特定基因修饰的细胞株，可根据实验所需表达外源基因、进行基因敲除、敲入、以及精确改变基因序列（如点突变）。对比一般瞬转方法，利用细胞稳转株开展实验能够获得长期而稳定的特定性状，因此有助于增强实验的可重复性。细胞稳转株除了可用于基因调控研究，也非常适合于长周期的药物筛选和药理学研究、重组蛋白和抗通过慢病毒系统或转座子系统将外源基因表达框稳定整合进靶细胞基因组，实现外源基因在靶细胞的长期稳定表达。对比瞬转方法，构建过表达稳转株可避免瞬转中因转染效率导致的表达效率不一致的问题。构建好的细胞株中的外源基因不会因为细胞传代而丢失，可以持续表达特定的基因或ncRNA序列用以基因功能研究，重复实验时不需要对细胞重新转染质粒，大为节省了实验时间。体生产等实验。载体家凭借其资源完备的载体定制平台，通过病毒转导常规肿瘤细胞的方式可构建多种应用类型的细胞稳转株。

　　构建CRISPR基因编辑细胞稳转株是当今研究基因和细胞功能关系的流行工具。通过gRNA引导Cas9靶向靶细胞基因组特定序列的CRISPR基因编辑，如基因敲除、敲入和定点突变，可以从DNA水平修饰靶细胞的基因序列。载体家提供两种gRNA表达模式，第一种是转导gRNA/Cas9共表达载体，gRNA和Cas9在细胞株中同时表达。第二种是构建Cas9表达稳转株，再根据实验需求导入gRNA表达载体。使用单Cas9表达稳转株可以获得更大的实验灵活性，如导入多个gRNA打靶GOI，或者多个gRNA与多种Cas9（野生型Cas9, Cas9n, dCas9等）之间进行搭配等。

　　CRISPR基因编辑系统可选择单gRNA或双gRNA表达方式。双gRNA表达载体常用于以下需要两个gRNA同时打靶的场景：1）双gRNA引导两个Cas9 nickase分别打靶靶位点的正反义DNA链，形成DSB并获得比单gRNA更特异的打靶效果；2）通过在形成两个DSB，实现目标序列的大片段删除；3）同时打靶两个不同的基因。双gRNA表达载体由两个U6启动子驱动gRNA的表达。

　　载体家CRISPR基因编辑载体可采用多类方式进行转导靶细胞。除基因敲入和定点突变常用的gRNA瞬转Cas9稳转株的方法外，我们还提供慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、PiggyBac转座子载体等多种外源基因转导方式，以满足体外或体内多样CRISPR基因编辑实验需求。

　　采用Tet-on系统进行诱导表达目的基因，虽然可以直接进行质粒瞬转，但是载体家亦提供该类载体的慢病毒包装以构建相关的稳转细胞株。构建好的Tet-On系统细胞株同时表达tTS和rtTA两种转录调控因子,而目的基因的表达可受四环素调控。其中tTS在四环素不存在的情况下会结合目的基因的上游TRE启动子，抑制目的基因表达。在细胞体系中添加四环素或其类似物后，rtTA进行响应并结合TRE启动子，激活目的基因表达。

　　shRNA稳转株一般使用慢病毒或逆转录病毒在靶细胞基因组中导入shRNA表达框，实现shRNA在细胞系中的长期稳定表达。不同于siRNA瞬转，shRNA稳转株可内源性地稳定表达siRNA效果，不受转染效率影响，从而获得更稳定的基因敲低效果。