蛋白制备

蛋白制备

1. 获得目的基因,克隆或合成目的基因  

2. 载体构建:,PCR方法:以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点)，PCR循环获得所需基因片段。②通过RT-PCR方法:用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成 cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物.构建重组表达载体载体酶切:将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。获得含重组表达质粒的表达菌种,将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志(抗Amp或蓝白斑)作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞5.氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导。②按1:50或1:100 的比例稀释过夜菌，一般转接1 mL过夜培养物于100 mL (含100 ug/mL氨苄青霉素)LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600 = 0.6-0.8(最好0.6，大约需3 h)。取10 ul样品用于SDS-PAGE分析。接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21菌株于5 mLLB液体培养基中(含100 ug/mL氨苄青霉素)，37℃震荡培养过夜。

②按1:50或1:100 的比例稀释过夜菌，一般转接1 mL过夜培养物于100 mL (含100 ug/mL氨苄青霉素)LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600 = 0.6-0.8(最好0.6，大约需3 h)。取10 ul样品用于SDS-PAGE分析。
③对照组不加诱导剂，实验组加入IPTG至终浓度0.5 mmol/l，37℃继续培养1-3 h.
12 000 rpm离心10 min，弃上清，菌体沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。
6.氯霆素酰基转移酶重组蛋白的分离、纯化
NTA层析柱的准备:在层析柱中加入1 mLNTA 介质，并分别用8 mL去离子水，8 mL上样缓冲液洗涤。
②重组蛋白的变性裂解:在冰浴中冻融菌体沉淀，加入5 mL上样缓冲液，用吸管抽吸重悬，超声波破裂菌体，用振荡器等轻柔的混匀样品60 min，4C 12000 rpm离心 30 min，将上清吸至一个干净的容器中，并弃沉淀。取10ul上清样品用于SDS-PAGE分析。

3. 蛋白表达与纯化③对照组不加诱导剂，实验组加入IPTG至终浓度0.5 mmol/l，37℃继续培养1-3 h.12 000 rpm离心10 min，弃上清，菌体沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。6.氯霆素酰基转移酶重组蛋白的分离、纯化NTA层析柱的准备:在层析柱中加入1 mLNTA 介质，并分别用8 mL去离子水，8 mL上样缓冲液洗涤。

4. 蛋白的大量表达与纯化②重组蛋白的变性裂解:在冰浴中冻融菌体沉淀，加入5 mL上样缓冲液，用吸管抽吸重悬，超声波破裂菌体，用振荡器等轻柔的混匀样品60 min，4C 12000 rpm离心 30 min，将上清吸至一个干净的容器中，并弃沉淀。取10ul上清样品用于SDS-PAGE分析。

蛋白制备

1.His、GST、MBP等标签多种表达方式同时进行，确保获得目的蛋白

2.保证蛋白为普通缓冲可溶

3.纯化的蛋白经过ELISA，Western-blot，或者其它生物活性验证

4.可提供详细表达纯化条件，实验数据以及菌株