质粒DNA提取质粒盒使用中的常见故障排除

 

　　最常见故障为DNA产量过低，主要成因包括菌液培养异常、裂解不充分、洗涤残留及洗脱效率低。菌液方面，若培养时间不足或转速过低，菌体浓度不足，需保证37℃、200-220rpm振荡培养12-16小时，避免过度培养导致菌体老化。裂解步骤中，裂解液与中和液比例失衡或混匀不充分，会影响菌体裂解和核酸释放，操作时需严格按说明书配比，温和颠倒混匀，避免剧烈震荡导致基因组DNA污染。洗涤环节若洗涤液未全离心去除，残留乙醇会抑制后续实验，需确保最后一次洗涤后充分离心，倒尽废液并晾干吸附柱。洗脱时，洗脱液体积不足、未预热或静置时间不够，会降低DNA回收率，建议使用50-100μL预热至65℃的洗脱液，滴加后静置2-5分钟再离心。

 

　　其次是DNA纯度差，表现为A260/A280比值偏离1.8-2.0范围，多由蛋白质、RNA污染或试剂残留导致。蛋白质污染源于裂解不好或中和不充分，可在裂解后增加离心时间，确保上清液澄清无沉淀；若仍有污染，可在洗脱前用蛋白酶K处理。RNA污染则是RNase失活或未添加，需检查RNase储存条件，使用前确认其活性，必要时在裂解液中额外添加RNaseA。试剂残留多为乙醇或盐离子，可通过增加洗脱前晾干时间、二次洗脱或用TE缓冲液替代水洗脱来解决。

 

　　离心后无上清液或吸附柱堵塞也是高频问题，主要因菌体过多、裂解液粘稠或离心参数不当。菌液接种量过大易导致裂解后溶液粘稠，建议按试剂盒要求控制接种量（通常1-5mL）。若离心后无上清，可适当提高离心转速和时间，若吸附柱堵塞，可将上清液过柱前再次离心，去除杂质后再上样。

 

　　此外，洗脱后无DNA可能是吸附柱失效或洗脱液pH不适宜。吸附柱需密封冷藏保存，避免受潮失效；洗脱液pH应维持在7.0-8.5，若pH过低会影响DNA与洗脱液结合，可调整缓冲液pH值后重新洗脱。